用普通光學(xué)顯微鏡觀察時(shí)，難以辨清這樣物體的結(jié)構(gòu)，必須借助于相差顯微鏡，使用固定和染色等理化方法，使樣品和背景的透射光在波長或振幅上發(fā)生變化，即在顏色和亮度上有所差異，以供識(shí)別。
生物學(xué)研究經(jīng)常要觀察又薄又透明的樣品，往往使用某種特定染料對(duì)細(xì)胞染色才可以觀察到，而使用相差顯微鏡則不需要對(duì)樣品進(jìn)行處理就可以直接對(duì)細(xì)胞進(jìn)行觀察。相差顯微鏡能觀察到透明樣品的細(xì)節(jié)，適用于對(duì)活體細(xì)胞生活狀態(tài)下的生長、運(yùn)動(dòng)、增殖情況及細(xì)微結(jié)構(gòu)的觀察。相差顯微鏡是微生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、細(xì)胞和組織培養(yǎng)、細(xì)胞工程、雜交瘤技術(shù)等現(xiàn)代生物學(xué)研究的必*工具。
使用相差顯微鏡注意事項(xiàng)：
1、光源要強(qiáng)，相差顯微鏡聚光鏡中的環(huán)狀光闌遮掉大部分光源，所以應(yīng)將視場光闌和孔徑光闌*開啟。
2、采用單色光，為了獲得良好效果，相差顯微鏡應(yīng)使用波長范圍窄的近于單色的光源，相位的變化常因照明光線的波長而不同。通常采用綠色濾光片來調(diào)整光源波長，*好按廠家專用相襯鏡檢的綠色濾光片進(jìn)行鏡檢。
3、切片要薄，以5~10μm左右為宜，或者更薄，如果樣品過厚，樣品的上層是很清楚的，深層則會(huì)模糊不清并且會(huì)產(chǎn)生相位移干擾及光的散射干擾，影響相差顯微鏡成象質(zhì)量。
4、載玻長、蓋玻片的厚度應(yīng)符合標(biāo)準(zhǔn)，且不應(yīng)有疵痕，制片的封固劑應(yīng)均勻一致。如果有劃痕，厚薄不均或凹凸不平，則會(huì)產(chǎn)生亮環(huán)歪斜及相位干擾。玻片過厚或過薄會(huì)使環(huán)狀光闌亮環(huán)變大或變小。相差顯微鏡觀察時(shí)要蓋上蓋玻片，否則環(huán)狀光闌的亮環(huán)和相板的暗環(huán)很難重合。
5、物鏡與聚光鏡匹配：注意相差物鏡和聚光鏡里的相差環(huán)要調(diào)成對(duì)應(yīng)的。簡單的方法就是物鏡上的Ph標(biāo)示與聚光鏡上的標(biāo)示相同，換物鏡時(shí)一定要記得把聚光鏡轉(zhuǎn)到對(duì)應(yīng)的位置。
6、相位倒轉(zhuǎn)，相差顯微鏡得到象的明暗反差正好相反。當(dāng)相位差δ=0時(shí)是無法識(shí)別的，隨著δ的增大反差變大，當(dāng)δ繼續(xù)增大到某一值后會(huì)出現(xiàn)相位倒轉(zhuǎn)。用90%高吸光值(高反差)物鏡時(shí)，這個(gè)轉(zhuǎn)變值約為0.55λ，用70%標(biāo)準(zhǔn)吸光值的物鏡時(shí)約為0.33λ。較高吸光值的物鏡應(yīng)該用于分辨較小的光程差。
7、暈輪和漸暗效應(yīng)
暈輪：由于相位的延遲而變暗時(shí)，并不是光的損失，而是光在象平面上重新分配的結(jié)果，因此在黑暗區(qū)域明顯消失的光會(huì)在較暗物體的周圍出現(xiàn)一個(gè)明亮的暈輪，當(dāng)環(huán)狀光闌很窄時(shí)暈輪現(xiàn)象更為嚴(yán)重。
漸暗效應(yīng)：相差觀察相位延遲相同的較大區(qū)域時(shí)，該區(qū)域邊緣會(huì)出現(xiàn)反差下降。
使用相差顯微鏡效果圖：